
PCR کمّی
تکنیک PCR اغلب برای تشخیص فراوانی یک توالی DNA هدف معین موجود در یک نمونه استفاده میشود.
PCR کمی (qPCR)، به عنوان "PCR در زمان واقعی" نیز شناخته میشود. البته نباید آن را با PCR رونویسی معکوس اشتباه گرفت.
در این روش DNA یا RNA نمونه (DNA در این مثال) در محلول با نوکلئوتیدهای آزاد و همچنین پرایمرهایی که در کنار یک ناحیه مورد نظر قرار دارند، قرار میگیرد. برخلاف PCR معمولی، این تکنیک شامل افزودن یک پروب DNA است که به خود ناحیه مورد نظر متصل میشود. این پروب به گونهای اصلاح شده است که شامل فلئوروفور و خاموش کننده (فرونشاننده) میشود. هنگامی که پروب DNA دست نخورده است، فلئوروفور و خاموش کننده به یکدیگر نزدیک هستند و نور ساطع نمیشود.
این واکنش حاوی یک DNA پلیمراز اصلاح شده است که هم قادر است DNA را بر روی یک رشته الگو بسازد و هم نوکلئوتیدهای از پیش موجود در مسیر خود را در هنگام انجام این کار حذف کند.
همانطور که در شکل نشان داده شده است، این واکنش تحت چرخه حرارتی قرار میگیرد. افزایش دما، DNA نمونه دو رشتهای را به قطعات تک رشته ای دناتوره میکند. هنگامی که سرد میشوند، پرایمرها و پروبهای DNA روی مناطق هدف مربوطه خود از DNA نمونه قرار میگیرند.
پس از این، DNA پلیمراز نیز ثابت میشود و شروع به کپی کردن DNA نمونه در محل پرایمر میکند. هنگامی که در مسیر خود با پروب DNA متصل روبرو میشود، آنرا از بین میبرد و نوکلئوتیدهای تشکیل دهنده آن را آزادانه در محلول آزاد میکند. این منجر به جدا شدن فلئوروفور از خاموش کننده و در نتیجه انتشار نور میشود.
همانطور که چرخههای PCR تکرار میشوند، فراوانی مقیاسهای نور انباشته شده به صورت نمایی، بر اساس مقدار اولیه پروب متصل شده و بنابراین، مقدار اولیه DNA نمونه حاوی توالی هدف مشخص میشود. این نور در طول زمان تشخیص داده میشود و شدت نور در هر سیکل PCR ثبت میشود. مقادیر بیشتر توالی هدف در DNA نمونه منجر به چرخههای PCR کمتری میشود که نور به یک مقدار آستانه مشخص برای تشخیص برسد. هرچه تعداد چرخهها کمتر باشد، مقدار DNA یا RNA بیشتر است.