توالی نسل سوم با خوانش طولانی: روش "TRUSEQ"

توالی نسل سوم با خوانش طولانی: روش "TRUSEQ"

این روش نمونه دیگری از رویکرد "خوانش طولانی مصنوعی" است، که در آن مولکول‌های طولانی DNA به طور مستقیم توالی‌بندی نمی‌شوند. بلکه به قطعات کوچک‌تر شکسته می‌شوند تا پس از پایان توالی‌یابی دوباره به قطعات بزرگ‌تر بازسازی شوند. در این روش، DNA نمونه قطعه قطعه می‌شود تا قطعاتی به طول تقریبی 10 کیلوبایت تولید شود. پس از شکسته شدن، این قطعات DNA با اتصال پرایمرهای تقویتی در هر دو انتها اصلاح می شوند. سپس این قطعات رقیق شده و روی یک پلیت 384 حفره‌ای قرار می‌گیرند به طوری که هر حفره تقریباً شامل 3000 تا 6000 قطعه است. سپس تقویت PCR در داخل هر چاهک انجام می‌شود.

  نکته مهم، این فرآیند شامل افزودن آداپتورهایی با بارکد منحصر به فرد برای هر حفره است. در نتیجه، پس از تکمیل تکثیر PCR، تمام قطعات DNA در هر حفره بارکد DNA منحصر به فرد مربوطه خود را به اشتراک می‌گذارند. پس از آماده‌سازی نمونه به این روش و تولید قطعات کوچکتر از قطعات بزرگتر، DNA از 384 حفره برای قطعات کوچکتر با طول تقریبی 400 جفت باز انتخاب می‌شود.

این‌ها جمع شده و در یک ابزار توالی‌یابی بارگذاری می‌‌شوند که در آنجا تحت توالی خوانش کوتاه قرار می‌گیرند.

هنگامی که توالی‌یابی کامل شد، از آمار (انفورماتیک) استفاده می‌شود تا توالی‌های DNA کوتاه را با استفاده از بارکدهای DNA مشترک آنها به توالی‌های طولانی‌تر تبدیل کند.