در این روش، DNA نمونه به قطعاتی تقسیم می‌شود که اندازه آن‌ها می‌تواند از 250 جفت باز تا بیش از 20000 جفت باز متفاوت باشد. این قطعات DNA متفاوت از سایر روش‌های توالی‌یابی، با افزودن دو گیره DNA، یکی در هر انتهای قطعه تهیه می‌شوند. همانطور که در شکل نشان داده شده است. با این گیره‌ها، قطعات DNA در صورت دناتوره شدن به حلقه‌های بسته DNA تبدیل می‌شوند و آماده‌سازی نمونه شامل خالص‌سازی انتخابی تنها این حلقه‌های DNA است.

ابزار توالی‌یابی خود شامل یک صفحه با تعداد زیادی حفره میکروسکوپی حاوی DNA پلیمراز است که در کف هر حفره چسبانده شده است.  DNA نمونه آماده شده، متشکل از حلقه‌های DNA، با غلظت کافی به پلیت اضافه می‌شود. به طوری که هر حلقه DNA در حفره خود ته نشین می‌شود.

DNA پلیمراز درون هر حفره به قسمتی از توالی حلقه متصل می‌شود که در تمام قطعات DNA یکسان است. با شروع توالی‌یابی، نوکلئوتیدهای آزاد با برچسب فلورسنت به پلیت اضافه می‌شوند.

این نوکلئوتیدهای آزاد توسط DNA پلیمراز در یک رشته مکمل در حال رشد گنجانده می‌شوند زیرا یک رشته مکمل برای حلقه DNA تک رشته ای ایجاد می‌کند. از آنجایی که DNA پلیمراز به کف حفره چسبانده شده است، ادغام پایه در پایه هر حفره رخ می‌دهد، جایی که برچسب فلورسنت هر نوکلئوتید اضافه شده توسط لیزر در زیر حفره تحریک می‌شود و نور ساطع شده توسط یک حسگر شناسایی می‌شود.

ادغام نوکلئوتید در زمان واقعی بدون نیاز به نوکلئوتیدهای پایان یا مراحل شستشو اتفاق می‌افتد.

یکی از مزایای منحصر به فرد این فناوری توالی‌یابی این است که می‌تواند برای توالی‌بندی قطعات بسیار طولانی استفاده ‌شود. همچنین می‌توان از آن برای توالی‌یابی مکرر قطعات کوتاه‌تر، از توالی‌یابی مکرر حلقه DNA مشابه در هر چاه استفاده کرد، که منجر به افزایش دقت باز می‌شود.

این توالی‌یابی، منجربه ایجاد یک سری زمانی از رنگ‌ها برای هر حفره در یک مکان مشخص روی پلیت می‌شود. نتیجه‌‌ی این روش، ایجاد یک توالی از جفت بازها برای هر حفره و طبیعتا برای هر قطعه DNA است.